柱式動物線粒體DNAout-PCR級-KLANG
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上海市閔行區(qū)
柱式動物線粒體DNAout,PCR級
產(chǎn)品及特點 線粒體 DNA(mtDNA)是進行分子進化研究和母性遺傳研究的重要材料,但傳統(tǒng)的兩步式 mtDNA 提取方法是先溫和裂解細胞,分離線粒體,然后再從線粒體中提取 mtDNA。此方法中的溫和裂解細胞的條件十分難以控制,需要針對不同組織材料單獨進行優(yōu)化。本方法克服了上述缺點,具有下列優(yōu)點:
1. 不需要單獨純化線粒體,柱式法純化,操作簡單快捷。
2. 得到的 mtDNA 可以直接用于 PCR。
3. 每 107個動物細胞一般能得到 100ng 左右的 mtDNA,每克組織一般能得到 3-5 ug mtDNA。
4. 注意:本產(chǎn)品只適合于動物材料,不適合于植物材料,因為植物線粒體 DNA一般都十分巨大,非常難提。
規(guī)格及成分 成 份 編 號 大扁盒包裝
柱式動物線粒體 DNA 提取溶液 A 80803A 13 mL 柱式動物線粒體 DNA 提取溶液 B 80803B 13 mL 柱式動物線粒體 DNA 提取溶液 C 80803C 18 mL 離心吸附柱 60911 50 套 通用洗柱液 60408 50 mL DNA 洗脫液 70705 10 mL 使用手冊 80803sc 1 份
運輸及保存 常溫運輸,短期可以在室溫放置;長期保存最好放 4℃。
自備試劑 無
使用方法
一:培養(yǎng)細胞預處理
1. 用自備的 0.25%胰酶消化液處理約 107個培養(yǎng)細胞,離心收集后棄上清。
2. 用 PBS 或 TBS 等緩沖液洗滌細胞兩次,離心得到的細胞沉淀直接用于mtDNA 提取。
二:組織細胞預處理
3. 用剪刀將 1g 新鮮的動物組織剪碎(芝麻大小最好),轉(zhuǎn)移到 1.5mL 塑料離心管中,用于 mtDNA 提取。注意:最好不要使用凍存的動物組織,因為凍凝過程中形成的冰晶會將線粒體刺破,使其 DNA 釋放出來被胞漿中的 DNA 酶降解,影響回收率。
三:血液預處理
4. 將 3-5 mL 抗凝外周血靜置 30 分鐘或低速離心 5 分鐘,取白細胞層。
5. 用自備 PBS 洗滌白細胞兩次,得到的白細胞沉淀用于 mtDNA 提取。四:mtDNA 提取
5. 在細胞沉淀或剪碎的組織中加入 250 uL 冰浴的溶液 A,充分吹打分散。如果是剪碎的組織,不要等成塊的組織溶解即可繼續(xù)下步操作。
6. 加入 250 uL 常溫的溶液 B(如果溶液 B 有沉淀,用前須 37℃加熱溶解后冷卻到室溫方可使用),溫和反復顛倒混勻 10 次。千萬不要劇烈振蕩。
7. 冰上放置 6-8 分鐘。注意不要超過 8 分鐘。
8. 加入 350 uL 冰浴的溶液 C,溫和混勻 4-6 次,可見白色沉淀物產(chǎn)生,然后放冰上放置 20-25 分鐘。
9. 室溫 12000-15000 g 離心 10 分鐘,小心將上清液轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中。由于此時的溶液比重較大,有時候出現(xiàn)沉淀漂浮是正?,F(xiàn)象,取上清時避開漂浮的沉淀即可。
10. 靜置 5 分鐘以讓 DNA 與離心吸附柱充分結(jié)合,此步十分重要。
11. 室溫 12000-15000 g 離心 1 分鐘,棄收集管中的廢液。
12. 加入 500 uL 的通用洗柱液,室溫 12000-15000 g 離心 1 分鐘,棄收集管中廢液。注意:通用洗柱液中含乙醇,用后需要將蓋擰緊存放,否則乙醇會揮發(fā)。
13. 重復上步 1 次。
14. 室溫 12000-15000 g 離心 1 分鐘,甩干殘留液體。此步不能省略,否則殘留乙醇會影響 DNA 的后續(xù)使用(如 DNA 上樣時不能沉淀到加樣孔中)。
15. 將離心吸附柱置于一個新的 1.5 mL 塑料離心管中,加入 30-50 uL65-80℃預熱的 DNA 洗脫液,室溫放置 2 分鐘。常溫的 DNA 洗脫液也可以用于洗脫,但產(chǎn)量稍微有所降低。
16. 室溫 12000-15000 g 離心 1 分鐘,離心管底溶液即 mtDNA。
17. 由于本公司離心吸附柱結(jié)合 DNA 能力較強,如果再加 30-50 uL DNA 洗脫液到離心吸附柱中,往往還能洗脫下很多 mtDNA(相當于第一次洗脫的 20-30%),但注意不要使用上步得到的 mtDNA 溶液來洗脫。
18. 12000-15000 g 離心 1 分鐘,離心管底溶液即線粒體 DNA。每 107個動物細胞一般能得到 100ng 左右的 mtDNA,每克組織一般能得到 3-5 ugmtDNA。如果 DNA 需要濃縮,可以使用本公司的核酸濃縮劑。
19. 由于 DNA 機械斷裂,電泳時 DNA 可能不呈現(xiàn)專一的帶,但此 mtDNA 溶液可以直接用于 PCR。
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