1 依據(jù)

本指導(dǎo)原則依據(jù)食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 15193系列標(biāo)準(zhǔn)制定。

2 范圍

本指導(dǎo)原則適用于保健食品及其原料的安全性毒理學(xué)的檢驗與評價。

3 受試物

3.1 受試物為保健食品或保健食品原料。

3.2 資料要求

3.2.1 應(yīng)提供受試物的名稱、性狀、規(guī)格、批號、生產(chǎn)日期、保質(zhì)期、保存條件、申請單位名稱、生產(chǎn)企業(yè)名稱、配方、生產(chǎn)工藝、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、保健功能以及推薦攝入量等信息。

3.2.2 受試物為保健食品原料時，應(yīng)提供動物和植物類原料的產(chǎn)地和食用部位、微生物類原料的分類學(xué)地位和生物學(xué)特征、食用條件和方式、食用歷史、食用人群等基本信息，以及其他有助于開展安全性評估的相關(guān)資料。

3.2.3 原料為從動物、植物、微生物中分離的成分時，還需提供該成分的含量、理化特性和化學(xué)結(jié)構(gòu)等資料。

3.2.4 提供受試物的主要成分、功效成分/標(biāo)志性成分及可能含有的有害成分的分析報告。

3.3 受試物的特殊要求

3.3.1 保健食品應(yīng)提供包裝完整的定型產(chǎn)品。毒理學(xué)試驗所用樣品批號應(yīng)與功能學(xué)試驗所用樣品批號一致，并且為衛(wèi)生學(xué)試驗所用三批樣品之一（益生菌、奶制品等產(chǎn)品保質(zhì)期短于整個試驗周期的產(chǎn)品除外）。根據(jù)技術(shù)審評意見要求補做試驗的，若原批號樣品已過保質(zhì)期，可使用新批號的樣品開展試驗，但應(yīng)提供新批號樣品按產(chǎn)品技術(shù)要求檢驗的全項目檢驗報告。

3.3.2 由于推薦量較大等原因不適合直接以定型產(chǎn)品進行試驗時，可以對送檢樣品適當(dāng)處理，如濃縮等。為滿足安全倍數(shù)要求，可去除部分至全部輔料，如去除輔料后仍未達到安全倍數(shù)要求，可部分去除已知安全的食品成分等。應(yīng)提供受試樣品處理過程的說明和相應(yīng)的證明文件，處理過程應(yīng)與原保健食品的主要生產(chǎn)工藝步驟保持一致。

4 毒理學(xué)試驗的主要項目

依據(jù)食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 15193的相關(guān)評價程序和方法開展下列試驗。

4.1 急性經(jīng)口毒性試驗

4.2 遺傳毒性試驗：細菌回復(fù)突變試驗，哺乳動物紅細胞微核試驗，哺乳動物骨髓細胞染色體畸變試驗，小鼠精原細胞或精母細胞染色體畸變試驗，體外哺乳類細胞HGPRT基因突變試驗，體外哺乳類細胞TK基因突變試驗，體外哺乳類細胞染色體畸變試驗，嚙齒類動物顯性致死試驗，體外哺乳類細胞DNA損傷修復(fù)（非程序性DNA合成）試驗，果蠅伴性隱性致死試驗。

遺傳毒性試驗組合：一般應(yīng)遵循原核細胞與真核細胞、體內(nèi)試驗與體外試驗相結(jié)合的原則，并包括不同的終點（誘導(dǎo)基因突變、染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)量變化），推薦下列遺傳毒性試驗組合：

組合一：細菌回復(fù)突變試驗；哺乳動物紅細胞微核試驗或哺乳動物骨髓細胞染色體畸變試驗；小鼠精原細胞或精母細胞染色體畸變試驗或嚙齒類動物顯性致死試驗。

組合二：細菌回復(fù)突變試驗；哺乳動物紅細胞微核試驗或哺乳動物骨髓細胞染色體畸變試驗；體外哺乳類細胞染色體畸變試驗或體外哺乳類細胞TK基因突變試驗。

根據(jù)受試物的特點也可用其他體外或體內(nèi)測試替代推薦組合中的一個或多個體外或體內(nèi)測試。

4.328天經(jīng)口毒性試驗

4.4致畸試驗

4.590天經(jīng)口毒性試驗

4.6 生殖毒性試驗

4.7 毒物動力學(xué)試驗

4.8 慢性毒性試驗

4.9 致癌試驗

4.10慢性毒性和致癌合并試驗

5毒性試驗的選擇

5.1 保健食品原料

需要開展安全性毒理學(xué)檢驗與評價的保健食品原料，其試驗的選擇應(yīng)參照新食品原料毒理學(xué)評價有關(guān)要求進行。

5.2保健食品

5.2.1 保健食品一般應(yīng)進行急性經(jīng)口毒性試驗、三項遺傳毒性試驗和28天經(jīng)口毒性試驗。根據(jù)實驗結(jié)果和目標(biāo)人群決定是否增加90天經(jīng)口毒性試驗、致畸試驗和生殖毒性試驗、慢性毒性和致癌試驗及毒物動力學(xué)試驗。

5.2.2 以普通食品為原料，僅采用物理粉碎或水提等傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)、食用方法與傳統(tǒng)食用方法相同，且原料推薦食用量為常規(guī)用量或符合國家相關(guān)食品用量規(guī)定的保健食品，原則上可不開展毒性試驗。

5.2.3 采用導(dǎo)致物質(zhì)基礎(chǔ)發(fā)生重大改變等非傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)的保健食品，應(yīng)進行急性經(jīng)口毒性試驗、三項遺傳毒性試驗、90天經(jīng)口毒性試驗和致畸試驗，必要時開展其他毒性試驗。

6特定產(chǎn)品的毒理學(xué)設(shè)計要求

6.1 針對產(chǎn)品配方中含有人體必需營養(yǎng)素或已知存在安全問題的物質(zhì)的產(chǎn)品，如某一過量攝入易產(chǎn)生安全性問題的人體必需營養(yǎng)素（如維 生素A、硒等）或已知存在安全問題物質(zhì)（如咖 啡因等），在按其推薦量設(shè)計試驗劑量時，如該物質(zhì)的劑量達到已知的毒性作用劑量，在原有劑量設(shè)計的基礎(chǔ)上，應(yīng)考慮增設(shè)去除該物質(zhì)或降低該物質(zhì)劑量（如降至未觀察到有害作用劑量）的受試物劑量組，以便對受試物中其他成分的毒性作用及該物質(zhì)與其他成分的聯(lián)合毒性作用做出評價。

6.2 推薦量較大的含乙醇的受試物，在按其推薦量設(shè)計試驗劑量時，如超過動物最大灌胃容量，可以進行濃縮。乙醇濃度低于15％（V/V）的受試物，濃縮后應(yīng)將乙醇恢復(fù)至受試物定型產(chǎn)品原來的濃度。乙醇濃度高于15％的受試物，濃縮后應(yīng)將乙醇濃度調(diào)整至15％，并將各劑量組的乙醇濃度調(diào)整一致。不需要濃縮的受試物，其乙醇濃度高于15％時，應(yīng)將各劑量組的乙醇濃度調(diào)整至15％。在調(diào)整受試物的乙醇濃度時，原則上應(yīng)使用生產(chǎn)該受試物的酒基。

6.3 針對適宜人群包括孕婦、乳母或兒童的產(chǎn)品，應(yīng)特別關(guān)注是否存在生殖毒性和發(fā)育毒性，必要時還需檢測某些神經(jīng)毒性和免疫毒性指標(biāo)。

6.4有特殊規(guī)定的保健食品，應(yīng)按相關(guān)規(guī)定增加相應(yīng)的試驗，如含有益生菌、真菌等，應(yīng)當(dāng)按照《保健食品原料用菌種安全性檢驗與評價技術(shù)指導(dǎo)原則》開展相關(guān)試驗。

7 動物實驗設(shè)計共性問題

7.1 受試物的前處理

7.1.1袋泡茶類受試物的提取方法應(yīng)與產(chǎn)品推薦飲用的方法相同，可用該受試物的水提取物進行試驗。如果產(chǎn)品無特殊推薦飲用方法，水提取物可采用以下提取條件進行：常壓、溫度80℃～90℃，浸泡時間30 min，水量為受試物質(zhì)量的10倍或以上，提取2次，將提取液合并濃縮至所需濃度，并標(biāo)明該濃縮液與原料的比例關(guān)系。如產(chǎn)品有特殊推薦服用方法（如推薦食用浸泡后的產(chǎn)品），在毒理學(xué)試驗設(shè)計時應(yīng)予以考慮。

7.1.2液體受試物需要進行濃縮處理時，應(yīng)采用不破壞其中有效成分的方法。可使用溫度60℃～70℃減壓或常壓蒸發(fā)濃縮、冷凍干燥等方法。液體受試物經(jīng)濃縮后達到人體推薦量的試驗要求，如不能通過灌胃給予的，容許以摻入飼料的方式給予實驗動物。

7.1.3 不易粉碎的固體受試物（如蜜餞類和含膠基的受試物）可采用冷凍干燥后粉碎的方式處理，并在試驗報告中詳細說明。

7.1.4 含益生菌或其他微生物的受試物在進行細菌回復(fù)突變試驗或體外細胞試驗時，應(yīng)將微生物滅活，并說明具體方法。

7.1.5 對人體推薦量較大的受試物，在按其推薦量設(shè)計試驗劑量時，如超過動物的最大灌胃容量或超過摻入飼料中的限量（10％（w/w）），可允許去除無安全問題的部分至全部輔料或已知安全的食品成分進行試驗，并在試驗報告中詳細說明。

7.1.6 吸水膨脹率較高的受試物應(yīng)考慮受試物吸水膨脹后對給予劑量和實驗動物的影響，應(yīng)選擇合適的受試物給予方式（灌胃或摻入飼料）。如采用灌胃方式給予，應(yīng)選擇水為溶媒。

7.2 受試物的給予方式

7.2.1 受試物應(yīng)經(jīng)口給予。根據(jù)受試物的性質(zhì)及人體推薦攝入量，選擇摻入飼料或飲水、灌胃的方式給予受試物。應(yīng)詳細說明受試物配制方法、給予方法和時間。

7.2.2 灌胃給予受試物時，應(yīng)根據(jù)試驗的特點和受試物的理化性質(zhì)選擇適合的溶媒（溶劑、助懸劑或乳化劑），將受試物溶解或懸浮于溶媒中。溶媒一般可選用蒸餾水、純凈水、食用植物油、食用淀粉、明膠、羧甲基纖維素、蔗糖脂肪酸酯等，如使用其他溶媒應(yīng)說明理由。所選用的溶媒本身應(yīng)不產(chǎn)生毒性作用；與受試物各成分之間不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，且保持其穩(wěn)定性；無特殊刺激性或氣味。

7.2.3摻入飼料或飲水方式給予受試物時，應(yīng)保證受試物的穩(wěn)定性、均一性及適口性，以不影響動物攝食、飲水量和營養(yǎng)均衡為原則。當(dāng)受試物在飼料中的加入量超過5％（w/w）時，需考慮動物的營養(yǎng)需要，結(jié)合受試物的蛋白質(zhì)含量將各組飼料蛋白質(zhì)水平調(diào)整一致，并說明具體調(diào)整方法。飼料中添加受試物的比例最高不超過10％（w/w）。

7.3 實驗動物的選擇

實驗動物應(yīng)符合相應(yīng)國家標(biāo)準(zhǔn)的要求，同時結(jié)合保健功能（如輔助改善記憶、緩解體力疲勞等）的特點選擇適當(dāng)?shù)膶嶒瀯游锏钠废?、性別和年齡等。

8 試驗結(jié)果的判定與應(yīng)用

8.1 急性毒性試驗

8.1.1 原料

如LD50小于人的推薦（可能）攝入量的100倍，則一般應(yīng)放棄該受試物作為保健食品原料，不再繼續(xù)進行其他毒理學(xué)試驗。

8.1.2 保健食品

8.1.2.1 如LD50小于人的可能攝入量的100倍，則放棄該受試物作為保健食品。如LD50大于或等于100倍者，則可考慮進入下一階段毒理學(xué)試驗。

8.1.2.2 如動物未出現(xiàn)死亡的劑量大于或等于10g/kg·BW（涵蓋人體推薦量的100倍），則可進入下一階段毒理學(xué)試驗。

8.1.2.3 對人的可能攝入量較大和其它一些特殊原料的保健食品，按最大耐受量法給予最大劑量動物未出現(xiàn)死亡，也可進入下一階段毒理學(xué)試驗。

8.2 遺傳毒性試驗

8.2.1 如三項試驗均為陰性，則可繼續(xù)進行下一步的毒性試驗。

8.2.2 如遺傳毒性試驗組合中兩項或以上試驗陽性，則表示該受試物很可能具有遺傳毒性和致癌作用，一般應(yīng)放棄該受試物應(yīng)用于保健食品。

8.2.3如遺傳毒性試驗組合中一項試驗為陽性，根據(jù)其遺傳毒性終點、結(jié)合受試物的結(jié)構(gòu)分析、化學(xué)反應(yīng)性、生物利用度、代謝動力學(xué)、靶器官等資料綜合分析，再選兩項備選試驗（至少一項為體內(nèi)試驗）。如再選的試驗均為陰性，則可繼續(xù)進行下一步的毒性試驗；如其中有一項試驗陽性，則應(yīng)放棄該受試物應(yīng)用于保健食品。

8.328天經(jīng)口毒性試驗

對只需要進行急性毒性、遺傳毒性和28天經(jīng)口毒性試驗的受試物，若試驗未發(fā)現(xiàn)有明顯毒性作用，綜合其他各項試驗結(jié)果可做出初步評價；若試驗發(fā)現(xiàn)有明顯毒性作用，尤其是存在劑量-反應(yīng)關(guān)系時，應(yīng)放棄該受試物用于保健食品。

8.490天經(jīng)口毒性試驗

根據(jù)試驗所得的未觀察到有害作用劑量進行評價，原則是：

a)未觀察到有害作用劑量小于或等于人的推薦（可能）攝入量的100倍表示毒性較強，應(yīng)放棄該受試物用于保健食品。

b)未觀察到有害作用劑量大于100倍而小于300倍者，應(yīng)進行慢性毒性試驗。

c)未觀察到有害作用劑量大于或等于300倍者則不必進行慢性毒性試驗，可進行安全性評價。

8.5 致畸試驗

根據(jù)試驗結(jié)果評價受試物是否為該實驗動物的致畸物。若致畸試驗結(jié)果陽性則不再繼續(xù)進行生殖毒性試驗和生殖發(fā)育毒性試驗。在致畸試驗中觀察到的其他發(fā)育毒性，應(yīng)結(jié)合28天和（或）90天經(jīng)口毒性試驗結(jié)果進行評價，必要時進行生殖毒性試驗和生殖發(fā)育毒性試驗。

8.6 生殖毒性試驗和生殖發(fā)育毒性試驗

根據(jù)試驗所得的未觀察到有害作用劑量進行評價，原則是：

a)未觀察到有害作用劑量小于或等于人的推薦（可能）攝入量的100倍表示毒性較強，應(yīng)放棄該受試物用于保健食品。

b)未觀察到有害作用劑量大于100倍而小于300倍者，應(yīng)進行慢性毒性試驗。

c)未觀察到有害作用劑量大于或等于300倍者則不必進行慢性毒性試驗，可進行安全性評價。

8.7 慢性毒性和致癌試驗

8.7.1 根據(jù)慢性毒性試驗所得的未觀察到有害作用劑量進行評價的原則是：

a)未觀察到有害作用劑量小于或等于人的推薦（可能）攝入量的50倍者，表示毒性較強，應(yīng)放棄該受試物用于保健食品。

b)未觀察到有害作用劑量大于50倍而小于100倍者，經(jīng)安全性評價后，決定該受試物可否用于保健食品。

c)未觀察到有害作用劑量大于或等于100倍者，則可考慮允許使用于保健食品。

8.7.2 根據(jù)致癌試驗所得的腫瘤發(fā)生率、潛伏期和多發(fā)性等進行致癌試驗結(jié)果判定的原則是（凡符合下列情況之一，可認為致癌試驗結(jié)果陽性。若存在劑量-反應(yīng)關(guān)系，則判斷陽性更可靠）：

a)腫瘤只發(fā)生在試驗組動物，對照組中無腫瘤發(fā)生。

b)試驗組與對照組動物均發(fā)生腫瘤，但試驗組發(fā)生率高。

c)試驗組動物中多發(fā)性腫瘤明顯，對照組中無多發(fā)性腫瘤，或只是少數(shù)動物有多發(fā)性腫瘤。

d)試驗組與對照組動物腫瘤發(fā)生率雖無明顯差異，但試驗組中發(fā)生時間較早。

致癌試驗結(jié)果陽性應(yīng)放棄將該受試物用于保健食品。